碘试验的配制

问题描述:

碘试验的配制

中药化学成分的预试验
系统预试法——应用一些简单的定性试验,对中药中所含各类化学成分作全面检查.
单项预试法——根据需要,有重点的检查某类成分或某药效成分.
方法:试管反应+薄层层析检查
中草药主要来源于植物.植物的化学成分较复杂,有些成分是植物所共有的,如纤维素、蛋白质、油脂、淀粉、糖类、色素等.有些成分仅是某些植物所特有的,如生物碱类、甙类、挥发油、有机酸、鞣质等.
各类化学成分均具有一定的特性,一般可由药材的外观、色、嗅、味等作为初步检查判断的手段之一.如药材样品折断后,断面不油点或挤压后有油迹者,多含油脂或挥发油;有粉层的多含淀粉、糖类;嗅之有特殊气味者,大多含有挥发油、香豆精、内酯;有甜奈者多含糖类;味若者大多含生物碱、甙类、苦味质;味酸者含有有机酸;味涩者多含有鞣质等等.
中草药所含化学成分均为多类的混合物,分析时常常互相干扰,不易得到正确结果.因此需根据中草药所含各种化学成分的溶解度、酸碱度、极性等理化性质,再用各类成分的鉴别反应加以鉴别.
一、 预试溶液的制备
1、 水提取液——糖、多糖、有机酸、皂苷、酚类、鞣质、氨基酸、多肽、蛋白质……
2、 乙醇提取液——酚类、鞣质、有机酸、香豆素、强心苷、黄酮、蒽醌、甾体……
3、 5%HCl-乙醇提取液——生物碱
4、 石油醚提取液——甾体、萜类、脂肪油……
(一)鉴别注意事项
1.根据各灰成分不同性质,选用适宜的溶剂提取,以保证等成分能被提取出来.
2.检品提取液的浓度应足以达到各该反应的灵敏度.
3.检品提取液的酸碱度(pH)值应不致影响鉴别反应中所需要的pH值.相差甚大时应事先调节.
4.提取液较深时,常易影响观察鉴别反应的效果,此时可适当稀释,或进一步提纯.
5.鉴别反应时应注意防止多类成分的相互干扰,以免出现假阳性,或颜色不正等情况.最好在化学鉴别的同时,做空白试验和对照试验(用已知含某类成分的中草药或纯品做阳性对照).
6.在鉴别试验中,如果某一类成分的几个鉴别反应结果不一致时(即有的呈阳性反应,有的呈阴性)则应进行全面分析.首先应注意呈阳性反应的试验是否属于该类成分的专一反应,否则应检查其他类成分能否产生该反应,从多方面加以判断.但也应注意,某些反应只能对某一类成分中的某个化学基团呈性反应,如检查黄酮类的盐酸――镁粉试验,它只对黄酮类中的羟基黄酮类(黄酮醇类)反应明显,其余类的黄酮类则不甚明显,但也不能轻易否定不是黄酮类,为了避免孤立和片面的下结论,一定要全面考虑综合分析.
中草药化学成分一般鉴别试验屯只是一个初步判断,最后确证尚需进一步提纯,以鉴定后才能予以肯定.
(二)鉴别方法
1、 氨基酸、多肽、蛋白质
(1)加热沉淀试验:加热煮沸 →混浊或沉淀 (蛋白质)
+5%H2SO4(不加热)→混浊或沉淀
(2)双缩脲反应:+40%NaOH,1%CuSO4 →紫色、红色或紫红色(多肽、蛋白质)
(3)茚三酮反应:+0.2%茚三酮试液 →蓝或蓝紫色(氨基酸、多肽、蛋白质)
(4)吲哚醌反应:+吲哚醌试液 →各种颜色(氨基酸)
(5)Millon反应:+Hg,H2NO2 →红色(蛋白质分子中有酪氨酸组成)
(6)Hopkins-Cole反应:+乙醛酸,浓硫酸 →各色(蛋白质分子中有色氨酸组成)
(7)氨基酸的薄层层析检查:吸附剂——硅胶G
展开剂—— n-BuOH,n-BuOH:HAc:H2O
显色剂——0.25%茚三酮试液 →紫红色斑点
(1)加热或矿酸试验:取检品的水溶液1ml于试管中,加热至沸或加5%盐酸,如发生混浊或有沉淀示含有水溶性蛋白质.
(2)缩二脲试验:取检品的水溶液1ml,加10%氧化钠溶液2滴,充分摇匀,逐渐加入硫酸铜试液,随加摇匀,注意观察,如呈现紫色或紫红色示可能含有蛋白质和氨基酸.
凡蛋白质结构中含有两个或两个以上肽键(-CONH-)者均有此反应,能在碱性溶液中与Cu2+生成仙络合物,呈现一系列的颜色反应,二肽呈蓝色,三肽呈紫色,加肽以上呈红色,肽键越多颜色越红.
(3)茚三酮试验,取检品的水溶液1ml,加入茚三酮试液2-3滴,加热煮沸4-5分钟,待其冷却,呈现红色棕色或蓝紫色(蛋白质、胨类、肽类及氨基酸).
氨基酸与茚三酮的水合作物作用,氨其酸氧化成醛、氨和二氧化碳,而茚三酮被还原成仲醇,与所后成的氨及另一分子茚三酮缩合生成有蓝紫色的化合物.
【注】①茚三酮试剂主要是多肽和氨基酸的显色剂,反应在1小时内稳定.试剂溶液pH值以5-7为宜,必要时可加吡啶数滴或醋酸钠调整. ②此反应非常灵敏,但有个别氨基酸不能呈紫色,而呈黄色,如脯氨酸.
(4)氨基酸薄层层析检出反应:
①吸附剂:硅胶G.
②展开剂:(1)正丁醇:水(1:1)(2)正丁醇:醋酸:水(4:1:5)
③显色剂:0.5%茚三酮丙酮溶液,喷雾后于1100烘箱放置5分钟,显蓝紫允或紫色.
2、 皂苷
(1)泡末试验:振摇 →大量持续性泡末
+0.1M HCl 二管泡末高度相同(三萜皂苷)
+0.1M NaOH 碱管高于酸管(甾体皂苷)
(2)溶血试验:+2%红血球悬浮液 →溶血
(3)Lieberman—Burchard反应:+醋酐-浓硫酸—— 紫红色(三萜皂苷)
黄-红-紫-污绿(甾体皂苷)
(1)泡沫试验:取检品的水溶液2ml于带塞试管中,用力振摇3分钟,即产生持久性蜂窝状泡沫(维持10分钟以上),且泡沫量不少于液体体积的1/3.
【注】常用的增溶剂吐温、司盘,振摇时均能产生持久性泡沫,要注意区别.
(2)溶血试验:取试管4支,分别加入滤液0.25、0.5、0.75 ml,然后依次分别加入生理盐水2.25、2.0、1.75、1.5 ml,使每一个试管中的溶液都成为2.5ml, 再将各试管加入2%的血细胞悬液2.5ml,振摇均匀后,同置于370水浴或25-270的室温中注意观察溶血情况,一般观察3小时即可,或先滴红细胞于显微镜下,然后滴加检液看血细胞是否消失.如有溶血现象示正反应.
【注】①鞣质对血红细胞有凝集作用,干扰溶血试验的观察,应事先除去(可用取胜酰胺粉吸附或用明胶沉淀). ②检液应为中性溶液.
(3)醋酐浓硫酸试验(Liebrmann Burchard反应)取检品的水溶液置蒸发皿中,于水浴上蒸干,残渣加入少量冰醋酸使溶解,再加入醋酐浓硫酸(19:1)试液,呈现红紫色并变成污色绿色(甾类、三萜类成分或皂甙)
(4)区别甾体皂甙和三萜皂甙:取带塞试管两支,各盛检品的水溶解1 ml,1支加0.1N盐酸溶液2ml,另一支加0.1N氢氧化钠溶液2ml用力振摇1分钟(需左右手交替振摇各半分钟),观察两管泡沫的多少,若两管泡沫体积相同或酸管多,示含三萜式皂甙;若加碱管泡沫多于加酸管示含甾示含甾体皂甙.
三萜皂甙为酸性皂甙在酸性水溶液中形成较稳定的泡沫;甾体皂甙为中性皂甙在碱笥溶液中能形成较稳定的泡沫.
浓硫酸、高氯酸、高氯酸-香草醛、浓硫酸-香草醛等的显色原理主要是使羧基脱水,增加双键结构,再经双键位移,双分子缩合等反应生成共轭双键系统,又在酸作用下形成阳碳离子盐而显色
3、 糖和苷
(1)斐林试剂:+硫酸铜、酒石酸钾钠 —— 砖红色沉淀(还原糖)
(—)+1%HCl +NaOH 沉淀(苷元)
△30min 上清液(+)(多糖、苷)
(2)Molish反应:+α-萘酚-浓硫酸 →紫红色环
(3)银镜反应:+0.1N硝酸银、5N氨水 →银褐色(还原糖)
(4)薄层层析检查::吸附剂——硅胶G或纤维素
展开剂—— n-BuOH:Pd:H2O;15%HAc
显色剂—— 苯胺-邻苯二甲酸
(1)碱性酒石酸铜试液:取检品的水溶液1-2ml(如为醇溶液须将醇蒸发除去),加入碱笥酒石酸铜试液1ml,于沸水浴上加热5分钟,产生棕红色或砖红色氧化亚铜沉淀,示有还原糖.
还原糖能使二价铜盐(蓝色)还原成氧化亚铜,醛糖的醛基氧化成羧基:
【注】①如检液呈酸性,应先碱化. ②此反应所产生的沉淀由于条件不同,其颜色也不同,质点上的呈黄色,质点大的呈红色.有保持性胶体存在时,也常产生黄色沉淀. ③职样品中含有其他醛、酮及还原较强的其他成分,或中划药制剂中附加的抗氧剂、;葡萄糖等均可显阳性反应.
(2)α萘酚试验(Molisch紫环反应):取检品的水溶液1ml,加5%萘酚试液数滴振摇后,沿管壁滴入5-6滴浓硫酸,使成两液层,待2-3分钟后,两层液面出现紫红色环(糖、多糖或甙类).
多糖类遇浓硫酸被水解成单糖,单糖被浓硫酸脱水闭环,形成糠醛类化合物,在浓硫酸存在下与α萘酚发生酚醛缩合反应,生成紫红色缩合物.
【注】①甙的分子结构中含有糖基,一般属于单糖类,如葡萄糖,鼠李糖、半乳糖,但也有含二分子糖(双糖)或多分子糖(多糖).在上述反应条件下,甙被水解成单糖,因此甙萘酚试验,系分子中糖部分的反应. ②由于此反应较为灵敏,如有微量滤纸纤维或中草药粉末存在于溶液中,都能产生上述反应.故滤过时应加注意.
(3)多糖的确证试验:取检品的水溶液5ml于水蒸发至干,加入1ml蒸馏水,再加入乙醇5ml,如出现沉淀,滤过收集后用少量热乙醇洗涤,再将沉淀物溶于3ml蒸馏水中,做下例试验.
①碘试验:取检品的不溶液1ml,加碘试液1滴,观察颜色变化,如呈蓝黑色为地衣糖;紫黑色为糊精;蓝色加热消失,冷后蓝色再现为淀粉.
②多糖水取检品的水溶液1ml,加入稀盐酸5滴,置沸水浴中加热10-15分钟,然后用10%氢氧化钠液中和至中性,再加新配制的碱性酒石酸铜试淮4滴,另取检液1ml,不加酸水解直接加入上述试液4滴,两管同置水浴上煮沸5-6分钟.如果水解后生成棕红色常常物的量比未经水解的多,则示有多糖.
多糖水解后产生单糖,利用单糖的还原性,使铜离子还原成氧化亚铜.
4、 酚类和鞣质
(1)FeCl3试剂:+1%FeCl3试液 →蓝、暗绿或蓝紫色
(2)三氯化铁-铁氰化钾试剂:喷洒→蓝色斑点
(3)香草醛-盐酸试剂:喷洒 →红色(间苯二酚、间苯三酚)
(4)重氮盐试剂:+对硝基苯胺、亚硝酸钠 →红色
(5)薄层层析检查:吸附剂——硅胶G或纤维素
展开剂—— n-BuOH:HAc:H2O;15%HAc
显色剂——1% FeCl3试液
1%三氯化铁-1%铁氰化钾试液 →蓝、绿或黑色
鞣质与酚类的区别:+明胶 —— 沉淀
上清液 +1%FeCl3试液 →蓝、暗绿或蓝紫色
(1)三氯化铁试验:取检品的水溶液1ml,加三氯化铁试液1-2滴,呈现绿色、污绿色、蓝黑色或暗紫色(可水解鞣质显蓝一蓝黑色,缩合鞣显绿色一污绿色).
鞣质均是多羟基酚的衍生物,即多元酚,能和三价铁离子发生颜色反应生成复杂的络盐.
【注】此反应如遇有矿酸或有机酸、醋酸盐等存在,能阻碍颜色的生成.硝基酚类对三氯化铁试剂无明显反应.
(2)明胶试验:取检品的水溶液1ml,加氯化钠明溶液2-3滴,即生成白色沉淀物.
鞣质有凝固蛋白的性能.
(3)溴试验:取检品的水溶液1ml,加溴试液1-2滴,生成白色或沉淀物,示可能含有酚或儿茶酚鞣质.
【注】过多的溴会阻碍鞣质的沉淀,因此溴水不宜多加.
(4)香草醛一酸试验:取检品的水溶液点于滤纸片上,干后,喷雾或滴加香草醛一盐酸试液,呈现红色斑点(多元酚类物质).
(5)鞣质、酚类薄层层析检出反应:
①吸附剂:聚酰胺;硅胶;硅胶;石膏:水(5:1:7)调成状,涂成薄板,1050烘干45分钟.
②展开剂:乙醇:醋酸(100:2);正丁醇:乙酸乙酯:水(5:4:1);苯:甲醇(95:5).
③显色剂:10%三氯化铁溶液;1%三氯化铁乙醇溶液与1%铁氰化钾水溶液(1:1)显蓝一紫色斑点.
5.黄酮及其甙类
(1)盐酸-镁粉反应:+HCl-Mg →红色
(2)三氯化铝反应:+AlCl3 →黄色
(3)浓氨水反应:+NH3 →亮黄或橙色
(4)薄层层析检查:吸附剂——聚酰胺或硅胶G
(1)盐酸一镁(或锌)粉试验:取检品的乙醇溶液1ml,加放少量镁粉(或锌粉),然后加浓盐酸4-5滴,置沸水浴中加热2-3分钟,如出现红色示有游离黄酮类或黄酮甙(以同法不加镁或粉做一对照,如两管都显红色则有花色素存在.如继续加碳酸试液使成碱笥即变成紫色双转变为蓝色,即证明含花色素).
黄酮类的乙醇溶液,在盐酸存在的情况下,能被镁粉还原,生成花色甙元而呈现红色或紫色反应(个别为淡黄色、橙色、紫色或蓝色).这是由于酮类化合物分子中含有一个碱性氧原子,致能溶于稀酸中被还原成带四价的氧原子即锌盐.本法是鉴别黄酮类的一个反应.但花色素本身在酸性下(不需加镁粉)呈红色,应加以区别.
【注】①此反庆仅在化学结构中,第三位上带羟基的酮醇类显色较明显,而其它黄酮烷酮类均不甚明显.因此试验呈阴性反庆是不能做出否定的结论,尚需结合其他实验再做结论. ②试验应在醇中进行,水分多会影响颜色的生成.此反庆较慢,有时需置水浴上加热,以促使反应的进行.
(2)荧光试验:
①三氯化铝试验:取检品的乙醇溶液点于滤纸片上(干后再点1次,使其浓度庥中),干后,喷雾1%三氯化铝乙醇试液,在紫外光灯下观察,呈现黄色、绿色、橙色等荧光为黄酮类;呈现天蓝色或黄绿色;荧光,则为二氢黄酮类.这是区别二氢黄酮类化合物的一种鉴别反应.
②硼酸丙酮枸橼酸丙酮试验:取检品的乙醇溶液1ml,在沸水浴上蒸干加入饱和硼酸丙酮溶液及10%枸橼酸丙酮溶液各0.5ml,蒸去丙酮后,在紫外光灯下观察,管内呈现强烈的绿色荧光(黄酮或其甙类).
(3)碱液试验:取检品的乙醇溶液点于滤纸片上(干后,再点一次,使其溶液集中),干后,喷1%碳酸钠溶液或在氨蒸气中熏几分钟,呈现亮黄、绿或橙黄色.如将氨气熏过的滤纸露置空气中,颜色逐渐裉去而变为原有的颜色(黄酮或其甙类).
5、 生物碱
(1)沉淀反应——碘化汞钾试剂 →白色或浅黄色沉淀
碘化铋钾试剂 →橘红色沉淀
碘—碘化钾试剂 →浅棕或暗棕色沉淀
硅钨酸试剂 →浅黄或黄棕色沉淀
磷钨酸试剂 →浅黄色沉淀
磷钼酸试剂 →白色或淡黄色沉淀
苦味酸试剂 →黄色结晶或非结晶形沉淀
鞣酸试剂 →棕黄色沉淀
氯化金试剂 →黄色结晶
氯化铂试剂 →白色结晶
雷氏铵盐 →红色无定形沉淀
(2)薄层层析检查:吸附剂——碱性氧化铝(Ⅲ级,干法铺板)
硅胶G(稀碱湿法铺板)
展开剂——氯仿:甲醇
显色——UV;碘化铋钾
6、 有机酸
(1)PH试纸检查
(2)溴酚兰试液:喷洒→蓝色背景黄色斑点
(3)薄层层析检查:吸附剂——硅胶G或酸性氧化铝
展开剂—— C6H6:EtOH
显色剂——0.1%溴酚兰试液→黄色
7、甾体
(1)Lieberman—Burchard反应:+醋酐-浓硫酸 →黄-红-紫-污绿
(2)氯仿-浓硫酸反应:+氯仿-浓硫酸 氯仿层→红或青色
硫酸层→绿色荧光
(3)五氯化锑或三氯化锑反应:+SbCl3或SbCl5 →红色
(4)薄层层析检查:吸附剂——中性氧化铝或硅胶G
展开剂—— C6H6-MeOH;CHCl3-MeOH
显色剂—— 10%磷钼酸 →蓝-蓝紫色
5%三氯化锑试液 →红、棕红或绿色
9、香豆素、内酯
(1)开闭环反应:+1%NaOH→澄清 +2%HCl→混浊
(2)异羟污酸铁反应:+7%盐酸羟胺、10%KOH △ +稀HCl、1%FeCl3 →红色
(3)重氮盐试剂:+对硝基苯胺、亚硝酸钠 →红色
(4)薄层层析检查:吸附剂——酸性硅胶G或硅胶G 或酸性氧化铝
展开剂—— 甲苯-乙酸乙酯-甲酸(5:4:1)
显色剂—— UV→蓝色荧光
异羟污酸铁试液 →红色
10、强心苷
(1)Kedde试剂:+3,5-二硝基苯甲酸试液 →紫红色
(2)Baljet试剂:+碱性苦味酸试液 →橙或橙红色
(3)Legal试剂:+亚硝酰铁氰化钠试液 →紫红色
(4)K-K反应:+FeCl3/冰HAc、浓H2SO4→ 上层绿~蓝色 (2-去氧糖)
界面红棕色
(5)薄层层析检查:吸附剂——硅胶G 或中性氧化铝
展开剂—— n-BuOH:HAc:H2O(4:1:5)
显色剂—— 碱性3,5-二硝基苯甲酸试液→紫红色
碱性苦味酸试液 →橙红色
11、蒽醌
(1)碱液反应:+10%NaOH →红色 +H2O2 →红色不褪 +H+ →红色褪去
(2)醋酸镁反应:+1%MgAc2 →红色
(3)薄层层析检查:吸附剂——硅胶G
展开剂——Pet:EtOAc
显色剂—— UV→黄色荧光
5%NaOH →红色
12、挥发油、油脂
(1)油斑检查:油斑挥发 →挥发油; 油斑不消失→油脂或类脂
(2)磷钼酸反应:喷洒5%磷钼酸试液 →蓝色(油脂、三萜、甾醇)
最后重点提醒:以上各试剂的配制方法最好参照药典来配制,原因一是上面写得很详细,二是药典中有个规定,药典上配制的溶液要是要用到乙醇的,如果没有指定用无水乙醇,一般是要用95%的乙醇的.
另外附一个试剂的配法:
氯化钠明胶试剂:(两者都是固体,刚开始我还真不知道怎样配,后来在药典才发现配方)2g氯化钠和1g明胶,再加上100g水,要求是现配的!